實時熒光定量 PCR（qPCR）自問世以來✘•·，就受到了廣大生命科學實驗工作者和醫院檢驗工作者的極大關注✘•·，使得該技術得到了很快的普及·│₪☁•。雖然qPCR技術目前應用方向十分廣泛✘•·，但是仍碰到很多使用者在實驗中存在著由於不當操作而資料精度不高·✘▩、重複性差·✘▩、可信度差等問題·│₪☁•。在這裡✘•·，我們根據實際工作中的經驗以及參考萬謙等人^[1]的研究✘•·，給大家詳細說明一些有助於提高實驗質量的操作技巧✘•·，希望能給大家帶來一定的幫助·│₪☁•。
 

1·✘▩、引物的操作技巧╃↟：

使用引物設計軟體進行設計時✘•·，在操作介面上設定相應的引數✘•·，擴增子引數一般設定範圍為80 ～ 200bp✘•·，擴增子長度越短✘•·，擴增效率越高✘•·，可選擇設定在110bp✘•·，110bp在後期的擴增中僅用10s✘•·，其餘的引數均預設✘•·，軟體即給出引物列表✘•·，一般選用評分高或者靠前的✘•·，因為評分越高或越靠前的引物對形成引物二聚體的可能越小·│₪☁•。
 

引物一般由試劑公司合成✘•·，為乾粉狀態✘•·，在溶解前✘•·，最好用高速離心機低溫快速離心30s✘•·，使得引物乾粉匯聚到管底✘•·，避免損失引物·│₪☁•。引物收到後✘•·，需要先摸索引物的退火溫度和終濃度✘•·，以達到較理想的qPCR擴增效果✘•·，其次測定引物的擴增效率✘•·，通常在非正式實驗時✘•·，假定引物的擴增效率為*✘•·，擴增產物在指數期呈現2n的增長·│₪☁•。在正式實驗時✘•·，考慮到引物的擴增效率實際不是100%✘•·，所以需要測定引物的擴增效率以修正結果·│₪☁•。一個測定引物擴增效率的簡單方法如下: 以cDNA樣品或標準品為模板✘•·，依次稀釋 10¹·✘▩、10²·✘▩、10³·✘▩、10⁴·✘▩、10⁵·✘▩、10⁶ 倍✘•·，採用前期摸索好的qPCR擴增條件✘•·，得到6個Cq值✘•·，然後以log（模板濃度）為X軸變數✘•·，以Cq值為Y軸變數作迴歸直線圖✘•·，得到直線的斜率✘•·，擴增效率 = 10( ^{－1 /斜率}) － 1✘•·，整個資料計算可以在Excel中完成✘•·，也可在qPCR軟體中直接得出·│₪☁•。
 

2·✘▩、反應體系配製技巧╃↟：

正式實驗時✘•·，每個樣本至少3個重複✘•·，為了消除各重複之間的系統誤差✘•·，可配置3.2個反應體系✘•·，將所需的所有試劑和模板加在同一個PCR管中✘•·，充分渦旋混勻後✘•·，再分裝到3個重複孔中✘•·，這樣可有效減小系統誤差·│₪☁•。另外✘•·，一些實驗者為了節省試劑✘•·，採用10μL反應體系✘•·，我們認為這是不可取的✘•·，因為體積太小✘•·，加樣誤差會大✘•·，這樣做得不償失✘•·，建議使用20μL以上的反應體積·│₪☁•。如上操作✘•·，可以在較大程度上消除由於加樣不準造成的系統誤差·│₪☁•。
 

如表1所列✘•·，“最佳化前”是5管中分別依次加入模板和各反應試劑✘•·，最後得到的Cq值標準偏差為2.66；“最佳化後”是使用模板和各反應試劑的混合液✘•·，然後分裝至5管中✘•·，最後得到的Cq值標準偏差為0. 32；由上述可見✘•·，資料精度得到極大的改善·│₪☁•。